《超级马里奥 64 DS》游戏是以 N64 的经典 3D 动作游戏为基础所制作，不同于 N64 版中玩家仅能操作马里奥，《超级马里奥 64 DS》游戏中将有马里奥、路易基、瓦里奥与耀西这四个角色可供玩家选择（初期只能使用耀西，其他角色需解救）。

除了角色增多之外，游戏的内容也大幅的增加，新增了许多关卡，能源之星的数目也增加到 150 颗。游戏利用 NDS（IDS）的无线网络功能来提供各种多人游玩模式，而且通过 Download Play, 多人模式只需要一个游戏卡带就可以使多人一同游玩。